Qué es y para qué sirve
Una columna HPLC es un tubo relleno de partículas cubiertas por una fase estacionaria. La fase móvil empuja la muestra a través del relleno y cada compuesto avanza a distinta velocidad según cuánto se «pega» a esa fase: así salen separados y el detector los mide uno por uno.
El modo de separación depende de la muestra. La fase reversa (C18, C8, fenilo, PFP) resuelve la mayoría de los métodos de moléculas pequeñas. Lo que no retiene en una C18 pasa a HILIC, a intercambio iónico o a columnas para azúcares y ácidos orgánicos. Los enantiómeros, las formas «espejo» de una molécula, piden una columna quiral. Los polímeros y las proteínas se separan por tamaño, con columnas SEC o GPC, para medir su peso molecular o detectar agregados.
La columna se desgasta con el uso: un cartucho guarda de la misma fase delante de ella retiene partículas y contaminantes y alarga su vida.
Cómo elegir una columna HPLC
Se escoge desde el método hacia la columna: primero el equipo y las medidas, después la química de la fase y, al final, el modo de separación, que es lo que más descarta.
1. ¿El equipo es HPLC convencional o UHPLC?
Decide el tamaño de partícula. Las partículas de 1,7 a 1,9 µm piden un equipo UHPLC: en un HPLC convencional pueden superar su presión máxima. Para UHPLC están las Raptor, Force y Pinnacle DB de Restek, con presiones de hasta 1034 bar en Raptor y Force, y las Ultisil UHPLC de Welch Materials. Para un HPLC convencional, partículas de 3 o 5 µm, como las Restek Ultra o la Roc, calificada para 400 bar.
2. ¿Qué diámetro interno y qué largo pide el método?
Decide la dimensión. Las columnas analíticas van de 2,1 a 4,6 mm de diámetro interno; las preparativas, para aislar y recolectar compuestos, son más anchas, como la Ultra C18 preparativa de Restek de 10 a 30 mm o las series Xtimate, Topsil y Welchrom de Welch Materials, que llegan a 50 mm, y a 70 mm en Xtimate C18. Más largo da más resolución y análisis más largos.
3. ¿Qué pH y qué fase móvil usa?
Decide el rango de pH y el tipo de C18. Fuera de su rango de pH la columna se degrada: las Raptor y Force trabajan entre 2,0 y 8,0, las Ultra y Roc entre 2,5 y 8,0, y Raptor ARC-18 y Raptor HILIC-Si desde 1,0. Con fase móvil 100 % acuosa corresponden fases que no colapsan en agua, como la Ultisil AQ-C18 o la Polar RP o la Allure Organic Acids de Restek para ácidos orgánicos.
4. ¿Qué química de fase reversa necesita?
Decide la selectividad. C18 es la fase de partida; C8 y C4 retienen menos; Biphenyl, fenilo y PFP cambian el orden de salida de aromáticos y bases cuando una C18 no separa. Para LC-MS/MS con poca preparación de muestra, Raptor ARC-18; para analitos que se pegan al metal, como las micotoxinas, las versiones Inert de Restek. La serie Ultisil suma C30 para isómeros de forma y una fase para PAH; Boltimate, de Welch Materials, usa partícula core-shell de 2,7 µm para métodos rápidos.
5. ¿El compuesto es muy polar, iónico o un azúcar?
Decide el modo de separación cuando la fase reversa no retiene. Compuestos muy polares: HILIC, con Raptor HILIC-Si de Restek o las fases amida, sílice, Amphion, diol y amino de Welch Materials. Azúcares, ácidos orgánicos, aniones y cationes: las series SUGAR, RSpak e IC de Shodex, o las Xtimate Sugar y las de intercambio iónico SCX y SAX de Welch Materials.
6. ¿Hay que separar enantiómeros o medir tamaño molecular?
Son los modos más específicos. Enantiómeros: columnas quirales Blossmate de Welch Materials, cuya fase se define con el compuesto. Peso molecular de polímeros y proteínas: GPC/SEC de Shodex, que se escoge primero por el solvente de la muestra (THF, DMF o agua), o las Xtimate SEC, Bio SEC y PEG-SEC de Welch Materials, por tamaño de poro.
