Así funciona un microscopio de fluorescencia

Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico convencional al que se le añade un adaptador de fluorescencia, el cual permite realizar la observación óptica de la muestra de manera tanto convencional como con contraste con fluorescencia.

Mientras que un microscopio convencional utiliza luz visible, que está entre los 400 y 700 nanómetros para iluminar y magnificar la imagen de una muestra, el microscopio de fluorescencia, por otro lado, usa una intensidad de la luz mucho mayor, la cual excita las especies marcadas con fluorescencia en la muestra. Estas especies emiten a su vez, una luz de menor energía, con una longitud de onda mayor que reproduce la imagen magnificada, en vez de la fuente de luz original.

Cuando a un microscopio convencional se le añade el adaptador de fluorescencia, se le denomina epifluorescencia, ya que la pieza se inserta por sobre el sistema óptico, logrando trabajar por reflexión lumínica. La mayoría de los microscopios utilizados en biología hoy en día son epifluorescentes.

El microscopio de fluorescencia funciona, en primera instancia, etiquetando la muestra de interés con una sustancia fluorescente, conocida como fluoróforo, para luego ser iluminada a través del lente con una luz de energía alta. La luz será absorbida por el fluoróforo y provocará la emisión de luz con baja energía y una larga longitud de onda. Esta luz fluorescente puede ser separada de la radiación que la rodea utilizando filtros diseñados para esa longitud de onda en específico, permitiendo que el observador visualice sólo aquello que es fluorescente. 

La función más básica de un microscopio de fluorescencia es la de permitir que la luz excitada irradie el espécimen, para luego separar la luz más débil emitida de la imagen. Primero, el microscopio tiene un filtro que solo deja que pase la radiación con una longitud de onda específica que sea la misma que la del material fluorescente. La radiación choca con los átomos en el espécimen y los electrones son excitados a un nivel de energía mayor. Cuando se relajan a un nivel menor, éstos emiten luz. Para ser detectables, o sea, visibles al ojo humano, la fluorescencia emitida desde la muestra es separada de la excitación más brillante con un segundo filtro. Esto funciona gracias a que la luz emitida es de una energía menor y con una longitud de onda mayor que la utilizada para la iluminación.

Para realizar un diagnóstico FISH (Fluorescence In Situ Hibridation) se utilizan moléculas con un fluoróforo determinado, para que al momento de iluminar la muestra, ésta se pueda ver de un color determinado. Para ello, se utilizan filtros específicos, llamados filtros de excitación, y así seleccionar e iluminar la muestra con una zona determinada del espectro visible.